A mikrobióta összetételének, változásának, illetve a gazdaszervezetre gyakorolt hatásának megismerésében az utóbbi évtizedben alapvetően új megközelítés, a metagenomika terjedt el.
A metagenomika előnye, hogy lehetőséget nyújt az adott mintában lévő összes ismert organizmus jelenlétének egyidejű kimutatására. Lényege, hogy nem magukat a mikroorganizmusokat, hanem azok örökítőanyagát, DNS-ét, RNS-ét használja, azaz tulajdonképpen nem közvetlenül a mikroorganizmusokat, hanem azok genomjainak összességét, az úgynevezett mikrobiomot vizsgálja, hagyományos tenyésztési módszerek alkalmazása nélkül. A mikrobiomon belül lehetőség van a bakteriom (baktériumok), virom (vírusok), mikobiom (gombák) stb. kimutatására. A minta minden összetevőjének genomját nevezzük összefoglaló néven metagenomnak.
A most megjelent, nemzetközileg is úttörőnek számító vizsgálat [Papp M, Békési L, Farkas R, Makrai L, Judge MF, Maróti G, Tőzsér D, Solymosi N (2022) Natural diversity of the honey bee (Apis mellifera) gut bacteriome in various climatic and seasonal states. PLoS ONE 17(9): e0273844. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0273844] hazai méhcsaládokból vett minták alapján ad megbízható képet a bélcsatorna mikroorganizmusainak változatosságáról, ami alapul szolgálhat méheinket fenyegető kórokozók, betegségek, esetleg méreganyagok hatásának jobb megértéséhez.
Ismert, hogy a Magyarország területén található méhészetek eltérő hőmérsékleti és csapadékviszonyok között dolgoznak, ami gyakran jelentősen befolyásolhatja az eredményességet is. A 2019-ben lefolytatott vizsgálatok fő célja az volt, hogy megismerjük eltérő körülmények között élő egészséges méhek bélbaktériumainak változását. Ebből a célból az ország 175 járásának éves csapadékmennyiségét és hőmérsékleti adatait hasonlítottuk össze az utóbbi tíz év átlagában (2008–2017). A hőmérsékleti értékekben két kategóriát állítottunk fel: melegebb–hidegebb. A csapadék szempontjából, az országos átlagokhoz viszonyítva, szárazabb, illetve nedvesebb volt a két kategória. Ennek alapján e négy kategóriának megfelelő húsz méhészetet jelöltünk ki a mintavételek céljából, amiben az OMME és a megyei szaktanácsadók nyújtottak segítséget (1. ábra).
A mintavételi periódusokban a méhek eltérő élettani állapotban voltak, ugyanis március során zömmel a kaptárban található élelmet fogyasztották, kevés virágporral. Május végén viszont bőséges természetes méhlegelő állt a rendelkezésükre.
Mindkét mintavétel során a kiválasztott méhészetek 3-3 családjából vettünk ki 20-20 darab lépen ülő élő méhet. A méheket szárazjégen szállítottuk be a laboratóriumba, majd −70 °C-os mélyhűtőben tároltuk feldolgozásig. Kérdőíveken rögzítettük a helyszínen a méhészet legfontosabb adatait, az egészségügyi helyzetet, az elvégzett kezeléseket stb. Ezekből kiderült, hogy a vizsgált méhészetekben az enyhe Varroa-fertőzésen kívül sehol sem észleltek fertőző betegséget, és mérgezés gyanúja sem merült fel.
A Szegedi Biológiai Kutatóközpont Növénybiológiai Intézetének laboratóriumában a bélminták mindegyikéből külön-külön kivontuk a bennük lévő DNS-t. Ezek a DNS-minták tartalmazzák a méh saját genomjának részeit (például bélhámsejtekből), a takarmányból (virágporból) származó DNS-t, valamint a bélben lévő mikroorganizmusok (vírusok, baktériumok, egysejtű lények stb.) DNS-ét. A nem kívánt, a vizsgálat szempontjából szennyeződésnek tekintendő szakaszokat a további elemzésekből kihagytuk. Az ismert genomok referenciaszekvenciái különböző adatbázisokból szerezhetők be, a „szennyező” genomok szekvenciáit az amerikai National Center for Biotechnology Information (NCBI) RefSeqgenom gyűjteményéből (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih. gov/genomes/) töltöttük le. A munka során azt vizsgáltuk, hogy valamely digitális szekvencia ráilleszthető-e valahol a referenciagenom szekvenciájára. Jelen vizsgálatunk csak a bélbaktériumokra (bakteriom) terjedt ki.
A mintában lévő DNS-szálak változó hosszúságúak, de nagy részük több tízezer, több millió bázis mérettartományba esik. Ezeket a hosszú szálakat a feldarabolás folyamata során enzimekkel még kisebb darabokra (ezres nagyságrendű bázisszámra) kell törni. A darabolás a kiindulási DNS véletlenszerű pontjain történik, ezért kis valószínűséggel fordulhat elő az, hogy ugyanazon DNS-szekvencia több példányánál is azonos pontokon történjen a tördelés. Az így létrejött, rövidebb DNS-szakaszok nukleotid-sorrendjét új generációs szekvenálással határoztuk meg.
Az így meghatározott DNS-darabok digitális megfelelője a leolvasott szekvencia, a read (olvasd: ríd). A szekvenálás eredményeként több százezer, több millió digitalizált szekvenciát kapunk. Az említett véletlen pontokon való hasítás eredményeként ugyanazon DNS-szakaszról is eltérő kezdőpontú, így legalábbis részben eltérő digitális szekvencia generálódik (úgynevezett shotgun-szekvenálás).
Eredményeink a következők voltak. A vándorlások miatt a májusi (második) mintavételnél 8 méhészet az eredeti klimatikus és időjárási kategóriából másikba került, ezeket a megfelelő helyen kellett kezelni. Néhány minta kiugró értékeket mutatott. A baktériumként jelölhető átlagos találat 6129, 62 836 és 270 774 faj volt. A leolvasott szekvenciák baktériumok referenciaszekvenciáira illesztésének rendszintű elemzése azt mutatta, hogy a legnagyobb gyakorisággal (47,4 százalék) a Lactobacillales rendhez tartozó fajok vannak jelen a béltartalomban. A leggyakoribb fajok (relatív gyakoriság a minták legalább felében, 2. ábra) a Bifidobacterium coryneforme, Bifidobacterium indicum, Commensalibacter sp. AMU001, Frischella perrara, Gilliamella apicola, Lactobacillus apis, Lactobacillus bombi, Lactobacillus helsingborgensis, Lactobacillus kullabergensis, Lactobacillus kunkeei, Lactobacillus mellis, Lactobacillus sp. wkB8, Snodgrassella alvi voltak.
Az észlelt sok hasonlóság mellett a bélbaktériumokban szignifikáns különbséget találtunk a melegebb és a hidegebb régiókban. A szezonális hatások (csapadék) viszont kevéssé érvényesültek a bélmikrobiomban.
Ennek ellenére számos olyan baktériumcsoportot találtunk, amelyek időben és a környezet változásával különbségeket mutattak. Így a Snodgrassella alvi a májusi mintákban emelkedett értékeket mutatott. Ez a baktérium minden bizonnyal a kikelő méhek első napjaiban népesíti be a bélcsatornát, és a másik leggyakoribb fajjal, a Gilliamella apicolával együtt képezi azt a biofilmet, amely a középbél nyálkahártyáját bevonja. Ez utóbbi volt a leggyakoribb faj a mi vizsgálatunkban is. Ez a két baktérium nemcsak hogy együtt fordul elő, de anyagcseréjükben is függnek egymástól (egyik a másik számára biztosít emésztőenzimeket). Ezeknek a baktériumoknak, a biofilmnek nagy szerepe van a különféle kórokozók elleni védekezésben, illetve az emésztésben (pollenfal bontó pektináz termelése).
Elsősorban a szénhidrátok emésztését segítik, ami a nektárt fogyasztó méhek esetében igen jelentős funkció. Nem elhanyagolható tényező, hogy elsősorban ezeknek a baktériumoknak köszönhető a méz közismerten jótékony humán táplákozás-élettani és terápiás hatása.
Még két baktériumcsoport, a Bartonella apis és a Commensalibacter fajok jelenléte, illetve gyakoriságuk változása volt jellegzetes a májusi mintákban. Ezek igazán nem tartoznak a méhek belének törzsflórájához, bár szerepük van a szénhidrát- és a nitrátanyagcserében. Ez utóbbi fontos lehet a nektárban és a virágporban található idegen metabolitok (méreganyagok) bontásában.
A méhek bélbaktériumainak időszakos változásában számos tényező játszhat szerepet. Ezek: a méhek gyűjtő funkciójának változása a család változó igénye szerint. A kaptár áthelyezése, a vándorlás a méhészeti szezon során, a látogatott méhlegelő hatása szintén jelentős lehet.
Saját vizsgálatunkban szignifikáns változást tapasztaltunk az úgynevezett fruktofil laktobaktériumok (FLAB) számának emelkedésében (például Lactobacillus kunkeei) a szárazabb és melegebb régióban, májusban. Ezek a mikroorganizmusok anyagcseréjükben előnyben részesítik a fruktózt a glükózzal szemben (invertcukor-etetés), és bizonyították szerepüket a virágpor érlelésében. Nagy adaptációs képességet mutatnak a környezetben, gyakran megtalálhatók a virágokon, így a mézben, virágporban, de például a borban is. Ezeknek a baktériumoknak fontos szerepet tulajdonítanak probiotikumok összetevőjeként (humán felhasználásra is) és olyan kórokozók elleni védekezésben, mint a Nosema-fajok, a Paenibacillus larvae és a Melisococcus pluton (nyúlós és európai költésrothadás). Ebből a csoportból általában a L. kunkeeit tartják a leggyakoribb fajnak, ezzel szemben mi a L. apist és a L. kullabergensist találtuk annak. Helyenként különbséget észleltünk még a Bartonella apis (gyakoribb a hideg és nedves régióban) és a Bifidobacterium asteroides (gyakoribb hideg régióban) számában. A Frischella perrara szintén a méhek belének törzsflórájához tartozó faj, amit saját vizsgálatunk is bizonyított.
Ezenkívül feltételezik, hogy szerepet játszanak a környezet egyéb ártalmai, mint peszticidek, herbicidek (glifozát) okozta szubletális mérgezések kivédésében is. Ezeknek a további vizsgálatához elengedhetetlen az egészséges méhek normál mikroflórájának ismerete, amelyhez ez a vizsgálat hasznos adatokat szolgáltat.
Más állatfajok esetében a bélbaktériumok megismerésének már több gyakorlati eredménye van. Ilyenek a probiotikumok, amelyeknek a bél mikroflórájára gyakorolt kedvező hatásával az állattartásban (sertés, baromfi – például a hizlalás eredményessége) vannak pozitív tapasztalatok, bár a mikroflórában bekövetkező változásokról keveset tudunk. A hagyományos mikrobiológiai eszközökkel nehéz ezekről átfogó ismereteket szerezni. Mindenesetre várható, hogy a bélflóra változékonyságának megismerése a precíziós állattartás eszköztárába is beemelhető gyakorlati eszközzé fog válni. A metagenomikai kutatások jelentősen gyarapítják tudásunkat nemcsak a humán egészségügy, hanem az állategészségügy és az állattartás szempontjából fontos területeken, így a méhészetben is.
Papp Márton, Békési László,
Farkas Róbert, Makrai László,
Maróti Gergely, Tőzsér Dóra,
Solymosi Norbert
A szerzők köszönetet mondanak a vizsgálatok szervezésében részt vevő Bross Péter OMME-elnöknek és a szaktanácsadóknak, valamint a közreműködő méhészeknek, akik név szerint: Balogh László, Benyovics József, Bíró Péter, Faragó Béla, Farkas Róbert, Fehér Tamás, Fele Tibor, Ferenczi József, Furján László, Kasza Lajos, Kéri György, Kiss János, Koncz Gusztáv, Kosztra Barnabás, Krjacsi József, Maróti Gábor, May Gábor, Molnár József dr., Szabó László, Tardi Antal László.
A költséges vizsgálatokat az European Social Fund (No. EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00005) támogatta. Hozzájárult még az EU Horizon 2020 kutatási és innovációs programja (874735 VEO), valamint az MTA Lendület Programja (LP2020-5/2020).
