A szőlőt fertőző vírusokról adott helyzetképet Várallyay Éva (MATE, Növényvédelmi Intézet). Az intézet keretében működő Genomikai Kutatócsoport tíz éve végez szőlővirológiai kutatásokat, amihez kis RNS-ek nagy áteresztőképességű szekvenálását használja. A HTS-módszerek segítségével a vizsgált mintában élő összes élőlényről információt szerezhetünk. A HTS-alapú kutatások során az elmúlt években egyre több szőlővírust írtak le, számuk ma már meghaladja a nyolcvanat.
Alanyültetvények felmérése
A szőlőt fertőző vírusokat az okozott tünetek alapján négy csoportba soroljuk, de ezekbe alig több mint harminc vírus tartozik. A fennmaradók általában látens, tünetmentes formában vannak jelen a szőlőben. Annak ellenére, hogy a vírusokat a tüneteik szerint csoportosítjuk, a meghatározásuk nagyon nehéz, mert a tünetek nem minden levélen, nem egyforma erősséggel jelennek meg.
A vegetációs időben folyamatosan változó víruskoncentráció, és sok más biotikus (pl. több vírus együttes fertőzése) és abiotikus tényező is befolyásolja a tünetek megjelenését.
A HTS-módszerrel kimutatott vírusok közül a szőlő Pinot gris vírus (GPGV) tüneteket okozó variánsának jelenléte lehet látható az érzékeny fajtákon. A HTS eddig nem ismert szekvenciájú vírusok jellemzésére is alkalmas. A kutatócsoport ennek használatával határozta meg a harminc éve Lehoczky János által leírt szőlő vonalas mintázottság vírus genomját.
A módszert virológiai felmérésekre használva a kutatócsoport hazai szőlő- és alanyültetvényekben végzett felmérései azt mutatták, hogy a termő ültetvényekben észlelt vírusfertőzés nem függ össze az ültetvény korával, fő meghatározója a fertőzött szaporítóanyag. Az alanyültetvények mentesek voltak a vizsgálatköteles vírusoktól. A nem vizsgált kórokozók közül azonban több vírus gyakran előfordult, és némelyikben a GPGV tünetes variánsa is felbukkant. A vírusok forrása a fertőzött importoltvány vagy az oltványkészítés során felhasznált fertőzött anyanövény vagy alany is lehet. A szaporítóanyag vírusmentes állapotának fenntartására az oltványkészítéshez felhasznált források folyamatos tesztelése, ha kell, vírusmentesítése szükséges. Ehhez nemcsak megfelelő érzékenységű diagnosztikai módszerekre, hanem hatékonyan működő vírusmentesítési eljárásokra is szükség van.
Biotechnológiai eljárások Kecskeméten
A vírusmentesítés optimalizálásában, kidolgozásában és kivitelezésében a MATE Szőlészeti és Borászati Intézetének kutatói vesznek részt. Munkájukról e sorok egyik szerzője, Turcsán Mihály PhD-hallgató (Kecskeméti Kutatóállomás) számolt be.
Szőlő- vírusmentesítéssel Magyarországon jelenleg kizárólag kecskeméti állomásunk foglalkozik, ahol egyedülálló módon a szőlőfajták és klónok széles körének mentesítésére alkalmas biotechnológiai eljárások állnak rendelkezésre (merisztéma- és hajtáscsúcstenyésztés, kemoterápia, szomatikus embriogenezis), amelyekkel sokszor a nehezen szövettenyészthető fajtákból is eliminálhatóak a vírusok, viroidok. A gyakorlati munkához alkalmazott és alapkutatás kapcsolódik, ami az utóbbi években számos tudományos publikációt eredményezett.
A merisztéma- és hajtáscsúcstenyésztést már régóta alkalmazzák a vegetatívan szaporított növények vírusmentesítésére. A szőlőben lévő vírusok egy csoportja, amelyeket floémre korlátozott vírusoknak is neveznek, a szőlő szállítószövet- rendszerében terjed. A merisztémákban ez az edénynyalábrendszer még nem alakult ki, ezért ezekből a kisméretű szövetekből (0,1-0,5 mm) egészséges növények nevelhetők fel. A merisztémák mikroszkóp alatt történő kipreparálása nagy gyakorlatot és gyors kivitelezést igényel, ugyanis azok gyorsan kiszáradhatnak, ami lehetetlenné teszi későbbi regenerációjukat. A merisztémák életben tartása és regenerációja is folyamatos figyelmet igényel.
Fontos lépés a különböző növekedést elősegítő hormonok megfelelő koncentrációban történő használata, a merisztémák rendszeres áthelyezése friss táptalajra, és a növekvő hajtások gyökeresedésének elősegítése is.
Egészséges hajtáscsúcsból
Tapasztalataink alapján a merisztémák regenerációs aránya 0 és 10% közötti, ami igen alacsony. Ennek növelésére jó lehetőség a nagyobb méretű (1-2 mm) hajtáscsúcsok használata, amelyek regenerációja akár 100%-os is lehet, ehhez azonban a hajtáscsúcs leválasztása előtt kiegészítő kezelések szükségesek. Ilyen például a növényi kemoterápia. Ennek során olyan antivirális szereket használunk, amelyek képesek gátolni a vírusok sokszorozódását, valamint számunkra kedvezően befolyásolják a növényen belüli eloszlásukat. Így az újonnan megjelenő hajtások vírusmentesek lehetnek, amelyekről akár egy 2 milliméteres hajtáscsúcs szabad szemmel történő leválasztásával is egészséges növényeket nevelhetünk fel. Ezeknek a hajtáscsúcsoknak a regenerációja hatékonyabb és gyorsabb is, mint a merisztémáké, így jelentősen gyorsíthatja a vírusmentesítés folyamatát.
Az elmúlt húsz évben olyan jelentős tüneteket okozó szőlővírusoktól szabadultak meg, mint a szőlő fertőző leromlás vírus (grapevine fanleaf virus – GFLV), a szőlő levélsodródás vírus 1 (grapevine leafroll-associated virus 1 – GLRaV-1), a szőlő levélsodródás vírus 3 (grapevine leafroll-associated virus 3 – GLRaV-3,) a szőlő rupestris faszöveti barázdáltság vírus (grapevine rupestris stem pitting-associated virus – GRSPaV), a szőlő vírus A (grapevine virus A – GVA) vagy az újabban leírt GPGV. Saját tapasztalataink alapján a módszer segítségével az egyik széles körűen elterjedt viroid, a komló satnyulás viroid (hop stunt viroid – HSVd) eltávolítása is lehetséges.
E két vírusmentesítési módszer előnye, hogy szabadföldi, üvegházi és fényszobában fenntartott növények hajtáscsúcsát is felhasználhatjuk, így egész évben próbálkozhatunk vírusmentesítéssel. Ugyanakkor számításba kell venni, hogy egyes fajták esetében nem garantált a siker. Ilyenkor jó alternatívát jelenthet egy harmadik módszer, a szomatikus embriogenezis alkalmazása.
Testi sejtekből
A szomatikus embriogenezis során a növény testi sejtjeit felhasználva embriók megjelenését idézzük elő, amelyekből egészséges növény nevelhető.
Az eljárás alkalmas vírusmentesítésre, ugyanis a vírussal vagy viroiddal fertőzött növényi sejtekből kis eséllyel fejlődik embrió, ráadásul az ilyen embriók életképessége is csökkent, ezért ritkán regenerálódik belőlük növény.
A szomatikus embriogenezishez felhasznált szövetek közül a legelterjedtebbek a virágzatban elhelyezkedő portokok és a magházak, de vágott mag, levél- vagy szárrészek, kacsok, akár teljes virágzat felhasználásával is értek el sikereket. Máig olyan jelentős megbetegedéseket okozó vírusoktól szabadultak meg a módszer használatával, mint a faszöveti barázdáltságot okozó GRSPaV, a GVA, a szőlő vírus D (grapevine virus D – GVD) és a szőlő vírus T (grapevine virus T – GVT), a fertőző leromlást okozó arabis mozaik vírus (arabis mosaic virus – ArMV) és GFLV, vagy a levélsodródás megbetegedést előidéző GLRaV-1, GLRaV-2 és GLRaV-3 vírusok, de a tüneteket ritkábban okozó GPGV és szőlő Syrah vírus 1 (grapevine Syrah virus 1 – GSyV-1) vírusok ellen is hatékonynak bizonyult. Ezenfelül a szőlőt leggyakrabban fertőző két viroid, a HSVd és szőlő sárga foltosság viroid 1 (grapevine yellow speckle viroid 1 – GYSVd-1) eltávolítása is lehetséges a módszerrel.
A szomatikus embriogenezis egyik nagy erőssége, hogy amennyiben a fajtán sikerrel lehet embriót létrehozni, akkor többnyire 100%-os hatékonysággal távolíthatók el a vírusok. A viroidok esetében a módszer nem mindig ilyen sikeres, de a merisztématenyészetek és a kemoterápia hatékonyságát rendszerint így is túlszárnyalja.
Ez a hátrány hajtatással csökkenthető, figyelembe kell azonban venni, hogy az ilyenkor nyert virágzatok és virágok kisebbek a szabadföldieknél.
A leírt vírusmentesítési módszerek mindegyike hatékony eszköze az egészséges szaporítóanyag előállításának, de sikerük egyértelműen fajtafüggő, ezért a vírusmentesítési folyamat során nem egyetlen módszert kell alkalmaznunk. Ez növeli az adott idő alatt létrehozott egészséges növényvonalak számát, amelyek mikroszaporítását és akklimatizációját követően megfelelő mennyiségű prebázis minősítésű szaporítóanyaggal rendelkezhetünk.
Az így létrehozott növényvonalak vírusmentességét a Nemzeti Élelmiszerlánc- biztonsági Hivatal illetékes szakemberei ellenőrzik. A szaporítóanyag csak ezt követően értékesíthető és telepíthető.
Turcsán Mihály, Oláh Róbert
MATE Szőlészeti és Borászati Intézet,
Kecskeméti Kutatóállomás
Várallyay Éva
MATE Növényvédelmi Intézet, Növénykórtani Tanszék, Genomikai Kutatócsoport
