0,00 HUF

Nincsenek termékek a kosárban.

2024. április 13.

Új generációs szekvenálás és a certifikáció

Az utóbbi évtized egyik legnagyobb technológiai újítása a biológiai kutatások terén a nagy áteresztőképességű szekvenálások (high-throughput sequencing – HTS) megjelenése volt. A témáról a szerző a 18. Növényorvos Napon tartott előadást.

E technológia fejlődése életünk minden részletére kihat, hiszen segítségével az emberi genom is egyre olcsóbban és egyre gyorsabban meghatározható, ezáltal azonosíthatók az örökletes génhibáink. A HTS a növénykórtani kutatásokat is forradalmasította.

A Földön élő összes élőlény rendelkezik nukleinsav-alapú örökítőanyaggal. A nukleinsavak négyféle nukleotidból épülnek fel, és e nukleotidok sorrendje a kód, ami meghatározza az adott élőlény összes tulajdonságát.

A szekvenálási folyamat során a nukleotidok sorrendjét határozzuk meg. Amíg 15-20 évvel ezelőtt egyszerre csak egy nukleinsav sorrendjét tudtuk meghatározni, ma a HTS-sel egyszerre több száz millió nukleinsav szekvenciája is megállapítható.

Felgyorsult az új kórokozók felfedezése

Törzsültetvénybe csak garantáltan kórokozó- mentes anyanövények kerülhetnek

Egy környezeti minta, például levélből kinyert összes nukleinsav HTS-ével a levélben levő összes élőlény: a gazdanövény, a kártevő és a kórokozó szekvenciája is megállapítható. Jelenleg a szekvenálás során csak a DNS nukleinsav-sorrendjét tudjuk meghatározni, így az RNS örökítő­anyaggal rendelkező kórokozók vizsgálata előtt az RNS-t DNS-sé kell átírnunk, de ez csak technikai részletkérdés.

Az adott mintából tisztított nukleinsav szekvenálásával megállapítható a benne levő összes gomba, baktérium, vírus, viroid, de akár kártevő jelenléte.

A szekvenálással kapott nukleotidsorrend elemzése komoly kihívás, csak bioinformatikai programokkal lehetséges: az olvasatokat – szekvenciákat –, melyek csupán 4 betű kombinációjából állnak, összehasonlítjuk a nemzetközi adatbankban levő összes ismert élőlény szekvenciájával. Az összehasonlítás eredménye egy találati lista, amely a mintában levő összes ismert élőlényt tartalmazza.

A HTS eredményéül kapott olvasatok azokról az élőlényekről is információt adnak, amelyek létezéséről előtte nem volt tudomásunk, így a módszer használatával példátlan mértékben felgyorsult az új vírusok, viroidok azonosítása. Ezek a mikrobák teljes mértékben a gazdaszervezetre utaltak, a növényi mintából való tisztításuk igen nagy kihívás. HTS-sel viszont izolálás nélkül is kimutatható a jelenlétük. A HTS-alapú virológiai felmérések elemzése meglepően sok új vírus leírásához vezetett. Almatermésű és csonthéjas gyümölcsfajok esetében a szekvenálási technológia felfedezésétől (1970-es évek) 2011-ig ötven vírust írtak le, míg 2020-ig ez a szám a duplájára nőtt és folyamatosan emelkedik. A szőlő esetében 2014-ig körülbelül harminc vírust írtak le, mára pedig több mint százat.

Illusztráció

Vegetatívan szaporított növények egészsége

A vegetatívan szaporított növényeknél kulcsfontosságú a szaporítóanyag kórokozó-mentessége.

A szaporítás alapjául szolgáló anyanövények növényvédő szerekkel mentesíthetők a bakteriális és gomba kórokozóktól, de a vírusoktól nem. Ha a kiindulási anyag ilyen kórokozókat tartalmaz, a fajtával együtt a kórokozót is szaporítani fogjuk. A globalizáció a fajták világkereskedelmét eredményezte, a klímaváltozás miatt pedig újabb és újabb növényfajokat honosítunk meg. Az import során alapvető, hogy az adott növény mentes legyen azoktól a kórokozóktól, kártevőktől, amelyek hazánkban nem honosak, hiszen behurcolásuk veszélyt jelent mind a termesztett fajokra, mind a természetes növényzetre.

Az érvényben levő szabályok biztosítják a karantén kórokozóktól való mentességet, míg a certifikációs rendszerek azt szabályozzák, hogy az adott fajok anyanövényei, az azokról szaporított minősített törzsültetvények, és az alanyültetvények ne hordozzák a jelen levő, de gazdasági károkat okozó vírusokat. Csak így érhető el, hogy a felhasználásukkal készült szaporítóanyagok, oltványok egészségesek legyenek.

A szaporítóanyagban jelen levő virális kórokozók kapcsán tehát az elmúlt években nagyon sok kérdés merült fel. Először is, mi az, amit szabályozni kell; másodszor, mi legyen a HTS-sel azonosított vírusokkal; harmadszor, milyen módszerekkel történjen a kimutatás; a negyedik pedig, hogy mi legyen a „fantom” kórokozókkal.

A HTS-sel leírt vírusok legtöbbje esetében nem áll rendelkezésre elég adat a kockázatbecsléshez, így nincs köztük, melynek a jelenléte Európában szabályozott lenne. Csak korrekt kutatási adatok alapján lehet majd eldönteni, hogy mely újonnan leírt vírus jelenlétét kell szabályozni, amihez megbízható, érzékeny diagnosztikai módszerekre van szükség.

Diagnosztikai módszerek

A kórokozókat alapvetően szerológiai (a kórokozó fehérjéjével reakciót adó ellen­anyagon alapuló), illetve PCR-alapú (a kórokozó nukleinsava specifikus szakaszának sokszorozásán alapuló) módszerekkel mutatjuk ki. Használatukhoz rendelkeznünk kell a kórokozóra specifikus ellenanyaggal, illetve ismernünk kell az örökítőanyagának legalább részleges szekvenciáját, hogy a PCR-reakcióhoz specifikus primereket tudjunk tervezni. A tesztek használatakor csak arra kapunk választ, hogy az éppen vizsgált kórokozó jelen van-e az adott mintában.

A virális kórokozók örökítőanyaga azonban folyamatosan változik, így olyan új variánsok jelenhetnek meg, melyeket a szerológiai tesztekben használt ellenanyagok, és a PCR-ben használt primerek nem képesek kimutatni.

A kórokozók jelenléte a növényben és így a szaporítóanyagban szezonálisan változik, néha egészen alacsony koncentrációjú, ami szintén lehetőséget ad az álnegatív diagnózisra.

A tesztelendő növényekben jelen lévő összes kórokozó kimutatására régóta bevált módszer a biotesztek használata. Az akár évekig tartó biotesztek során az indikátorfajtákon megjelenő tünetek jelzik, hogy a tesztelendő növény mentes-e minden gazdaságilag káros kórokozótól. A biotesztek indikátornövényeit hosszú évtizedekkel ezelőtt, az akkor ismert vírusokra optimalizálták, így sokszor álnegatív eredményt adnak. Másrészről a jelenleg érvényben lévő szabályozások meglepően sok olyan vizsgálandó „tünetet” is tartalmaznak, melyekről nem bizonyított, hogy vírusok okozzák. Ezen „fantom” kórokozók listáról való eltávolítására a szőlő- és a gyümölcsvírusokkal foglalkozó kutatók jelenleg gyűjtik össze a rendelkezésre álló, sokszor igen limitált és nem hozzáférhető információkat.

A biotesztek több év alatt vezetnek eredményre, értékelésükhöz komoly szaktudás kell

Nemzetközi virológiai konferenciák

Hosszabb kihagyások után idén került sor a szőlő- és a gyümölcsvírusokat és fitoplazmákat vizsgáló nemzetközi tudományos tanácsok konferenciájára Wageningenben júliusban (ICVF – gyümölcsvirológiai társaság) és Thessalonikiben szeptemberben (ICVG – szőlővirológiai társaság). A két konferencián nem meglepő módon igen hasonló kérdések és megoldási javaslatok kerültek előtérbe, kiemelten a fás szárú növények importja és a szaporítóanyag előállítása során érvényben levő szabályozások időszerű felülvizsgálata.

Mindkét konferencián külön szekciót szántak a diagnosztikára és a certifikációs szabályozásokra.

A HTS ez esetben már mint diagnosztikai megoldás is szerepel, hiszen egy lépésben mutatja ki az összes kórokozó jelenlétét. Ez a módszer nemcsak érzékenységében és hatékonyságában, hanem gyorsaságában is messze felülmúlja a bioteszteket.

A HTS rutin diagnosztikai használata azonban újabb kihívások elé állítja a kutatókat. Egyre több ajánlás, kidolgozott módszer van, melyek lépésről lépésre ismertetik a rutinszerű eljárás során felmerülő kockázatokat. A rutin használat bevezetése előtt kihívás a HTS-nek megfelelő minta-előkészítés, a szekvenálási adatok bioinformatikai elemzése, a megfelelő pozitív és negatív kontrollok megtalálása és rendszerbe illesztése. Ezek optimalizálásával megoldható lesz a megfelelő érzékenység (minél kisebb koncentrációban jelen levő kórokozót kimutasson, ne legyen fals negatív eredmény), a megbízhatóság (ne legyen fals pozitív eredmény), az ismételhetőség (ismételt teszt ugyanazt az eredményt adja) és a független módszerrel (pl. RT-PCR-rel) történő visszaigazolás.

Így ma már nem az a kérdés, hogy vajon a HTS elfogadott rutin diagnosztikai módszerré válik-e, hanem csak az, hogy mikor.
Új protokoll a szőlő- és a gyümölcsfa-vírusok certifikációjában

Forrás: Kertészet és Szőlészet

Szaklap, amelyben a cikk megjelent: